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实验室沉降离心机离心分离方法介绍

2012年04月06日 15:17:46来源:
  一、离心力的计算:
  
  离心机的加速度通常以重力加速度(g=9.80m/s2)的倍数来表示,称为相对离心力(RCF或“g值”)。RCF取决于转子的转速(n,以每分钟转数计r/min)和旋转半径(r,以mm计),可用公式表示如下:
  
  此公式变形后,在已知r和RCF的值时可以用来计算转速(r/min):
  
  然而,须留意到RCF值在离心管内并不是处处相等:在靠近转子外侧处的值zui大(rmax)靠近中心轴处的值zui小(rmin)。应用中,习惯上所说的RCF值都是指旋转的均匀半径(rav)。另外,需留意的是RCF的值是转速值的平方的函数,因此增加41%的速度就可使RCF进步两倍。
  
  二、离心分离的方法:
  
  1.差速沉降(沉淀)法:
  
  将一混合悬浮液以一定的RCF离心一定的时间后,混合物将会被分为沉淀和上清液两部分。从一种悬浮液中,增加RCF,以固定的离心时间连续分离沉淀的方法被广泛应用于从细胞匀浆中分离细胞器。(a)离心前盛在离心管内的是含有大、中、小三种颗粒的悬浮液;(b)低速离心后,沉淀主要由zui大的颗粒组成;(c)进一步用高速离心上清液,得到主要由中等大小颗粒组成的第二种沉淀;(d)zui后一步用离心把余下的小颗粒沉淀下来。
  
  差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是:操纵简单,离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是:①分离效果差,不能一次得到纯颗粒;②壁效应严重,特别是当颗粒很大或浓度很高时,在离心管一侧会出现沉淀;③颗粒被挤压,离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。


 
  2.密度梯度离心法:
  
  区带离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡,在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。该法的优点是:①分离效果好,可一次获得较纯颗粒;②适应范围广,既能分离具有沉淀系数差的颗粒,又能分离有
  
  一定浮力密度的颗粒;③颗粒不会积存变形,能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点:
  
  ①离心时间较长;②需要制备梯度;③操纵严格,不宜把握。
  
  下列技术使用了密度梯度,即离心管中的溶液从管中的溶液从管顶到管底密度逐渐增加:

  
  密度梯度。
  
  (a)连续密度梯度。(b)非连续密度梯度,以递减浓度的梯度平展叠加而形成。(c)单梯度密度屏障,设计用于选择性的沉降一种类型的颗粒
  
  3.差速区带离心法:
  
  将样品置于平缓的预先制好密度梯度介质上,进行离心,较大的颗粒将比较小的颗粒更快地沉降
  
  通过梯度介质,形成几个明显的区带(条带)。这种方法有时间限制,在任一区带到达管底之前必须停止离心。差速区带离心法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒,与密度无关。大小相同、密度不同的颗粒(如溶酶体、线粒体和过氧化物酶体)不能用本法分离。
  
  离心时,由于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后,沉降的颗粒逐渐分开,zui后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大,往下沉降的越快,所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒,则在较上部分依次出现。从颗粒的沉降情况看来,离心必须在沉降zui快的颗粒(大颗粒)到达管底前或刚到达管底时结束,使颗粒处于不*的沉降状态,而出现在某一些特定的区带内。
  
  在离心过程中,区带的位置和外形(或带宽)随时间而改变,因此,区带的宽度不仅取决于样品组分的数目、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性,也与离心时间有关。时间越长,区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间,并可减少扩散导致的区带加宽现象,增加区带界面的稳定性。
  
  4.等密度离心法:
  
  当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)形成区带,称为等密度离心法。等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效果越好,与颗粒的大小和外形无关。但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。颗粒的浮力密度不是恒定不变的,还与其原来密度、水化程度及梯度溶质的同透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。例如某些颗粒轻易发生水化使密度降低。
  
  这种技术根据浮力密度的不同分离物质。其分辨率受颗粒性质(密度、均一性、含量)、梯度性质(外形、粘度、斜率)转子类型、离心速率和时间的影响。颗粒区带宽度与梯度斜率、离心力、颗粒相对分子质量成正比。几种物质可通过离心法形成密度梯度(如蔗糖、葡萄糖、菲可、尼克登)。将样品与适当的介质混合后离心--各种颗粒在与其等密度的介质带处形成沉淀区带。这种方法要求介质梯度应有一定的陡度,要有足够的离心时间形成梯度颗粒的再分配,进一步离心对其不会有影响。
  
  可以使用一根细的巴氏滴管或带有细长针头的注射器来收集某个密度梯度内的条带。另一种方法可将试管刺穿,将内容物分段逐滴收集到几个管中。
关键词:实验室沉降离心机,分离方法
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