之前我们有几期文章介绍了使用默克Amicon® Ultra超滤管的应用场景(分离外泌体、浓缩病毒),有很多老师反馈了一些超滤管使用时的问题,针对其中问的比较多的问题,小编特意进行了收集、整理。今天给大家介绍超滤管的使用过程中,离心力g与RPM的换算及常见问题的解答。
测量转子的半径
从离心机厂家文件上查阅转子半径,或像以下图示这样自己测量转子半径。
采用列线图计算RPM
绘制转子半径和建议的RCF(离心力g)图,连线确定RPM。
此列线图实际是通过右侧的公式计算得出的。
Q1:Amicon® Ultra超滤管的膜材质是什么?
A1:Amicon® Ultra超滤管的膜材质为默克密理博Ultracel®再生纤维素膜,生产工艺严格,截留分子量明确而精准,蛋白吸附损失最小。
Q2:如果要用超滤的方法分离两种蛋白,那么这两个蛋白的大小需要相差多少?
A2:按照经验,建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级(10倍)。
Q3:Amicon® Ultra超滤管可以用于病毒浓缩么?
A3:可以。对于慢病毒推荐Amicon® Ultra 100 kDa; 对于腺病毒推荐Amicon® Ultra 50kDa。具体的操作步骤可以参考病毒浓缩纯化试剂盒FTLV00003和FTAV00003的产品使用说明书。另提供AAV(腺相关病毒)的制备方法供参考。
Q4: Amicon® Ultrar超滤管可以用酒精消毒灭菌么?
A4:Amicon® Ultra与70%乙醇是兼容的,但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试,所以无法提供更进一步的参考信息。建议采用Ultrafree无菌离心管对浓缩后的样品进行过滤除菌。
Q5:Amicon® Ultra超滤装置是否可以用于高压灭菌?
A5:Amicon® Ultra都是采用热封设计,不可以用高压高温灭菌。
Q6:Amicon® Ultra超滤管是否不含RNA酶?
A6:不保证超滤管不含RNA酶,建议用0.1% DEPC在37度浸泡2h,以灭活RNA酶;残留的DEPC可以用Milli-Q®超纯水洗涤除去。
Q7:用Amicon® Ultra超滤管去除去污剂是有什么需要注意的吗?
A7:去污剂因其性质,当浓度大于临界微团浓度(Critical Micelle Concentration, CMC)时,去污剂分子会聚集形成微团而改变分子构象,这有可能会影响去污剂的去除效果。
Q8:蛋白在浓缩时出现了沉淀,如何改进?
A8:蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白,建议的改进方法是:
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离心力降为推荐离心力的30%-50%;
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改用截留分子量更大的超滤管(如原本选用10k,此时可以选择30k);
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在浓缩过程中取出超滤管,用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩;
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体积较大的样品可考虑选用搅拌式超滤杯,减少沉淀的发生。
Q9:有时候用超滤离心管连水都离不下来,可能是什么原因?
A9: Amicon® Ultra超滤膜中含有微量甘油。 如果出现这种情况,请先用0.1N NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。
Q10:说明书中推荐在室温下进行离心,考虑到蛋白的稳定性,是否可以在4℃进行离心?
A10:可以,但是低温会增加蛋白样品的粘性,导致流速减慢,建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。
Q11:浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因有哪些?
A11:首先,Amicon® Ultra超滤管的蛋白zui低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次,如果问题仍然出现,请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因:
· 如果目的样本在滤过液中,那么请排查:
a)是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?
b)使用的离心力是否是在限定范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心力,具体换算方法请垂询。
c)离心机最近是否有校准过?
d)是否shou次尝试这个蛋白?如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话,那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性(构象差异)而影响浓缩效果,建议选用更小截留分子量的超滤管(如原本选用30k,此时可以选择10k)。
· 如果目的样本也不在滤过液中,那么:
a)蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL?
b)用来确定样本浓度的方法是什么?是否可信?
c)目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。
Q12:如何对超滤管进行去除内毒素的处理?
A12:提供的超滤管是没有经过去内毒素处理的,同时由于内毒素通常以多聚体的形式存在,大小在10-1000KD之间不等,在超滤的过程中是无法去除的。可在实验前通过先用0.5MNaOH预清洗,随后用Milli-Q®水/缓冲液清洗的步骤去除大部分内毒素。关于针对Amicon®、Microcon®、Centricon®尝试过的内毒素去除方案。
Q13:用浓缩后的蛋白做下游分析时发现有干扰,可能有哪些原因?
A13:Amicon®Ultra超滤膜含有微量甘油。如果此成分干扰分析,可用缓冲液或Milli-Q®水预清洗。如果干扰仍然存在,用0.1NNaOH清洗,然后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。
Q14:怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附,如何改善?
A14:Amicon® Ultra超滤管使用的是再生纤维素膜,这种材质是蛋白吸附zui低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白,它们和膜的非特异吸附可能会增强。对于这种情况,可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理,也可以尝试换成Amicon® Ultra 0.5或2来进行实验,通过减小膜面积来降低非特异性吸附。