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引言
以人类或动物细胞、组织及体液等生物材料为起始原料生产的生物制品，在其制备流程及制剂阶段，可能会引入人或动物源的原材料及辅助物质。这些起始原料、添加的原材料以及所使用的辅料，均存在遭受病毒污染的潜在威胁。
为了有效控制生物制品受病毒污染的风险，国内外监管机构均出台相关法规，强制要求生物制品的生产流程必须包含能够有效灭活或去除病毒的工艺步骤，以此来确保最终产品的生物安全性。
生物制品病毒污染的历史案例
病毒污染是构成治疗用生物制品安全性的重大威胁之一。过去，由于缺乏对病毒污染风险的充分认知，加之病毒检测技术与病毒灭活/去除手段存在局限性，血源性生物制品以及通过工程细胞与工程细菌表达生产的生物制品在生产流程中曾遭遇严重病毒污染事件。Table 1列举了部分生物制品遭受病毒污染的典型案例。
Table 1. 生物制品病毒污染案例
相关法规概览
随着对生物制品病毒安全控制要求的不断提升，基于各国药品监管机构与业界长期积累的丰富经验，一系列针对生物制品病毒安全控制与评估的法规和技术规范相继出台。以下是本文在撰写过程中主要参考的相关法规：
1）生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则，药品评审中心，2005
2）血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则，NMPA，2002
3）《中国药典》三部，生物制品通则-生物制品病毒安全性控制，2020
4）ICH Q5A（R1）：来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价，ICH，1999
5）Technical Report No.83-Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019
6）Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. FDA. 2011
病毒安全性评价范围
根据《中国药典》2020年版三部通则的要求，生物制品在病毒安全性控制方面需特别关注以下几类，并采取相应的预防措施：
1）人血液制品：由于原料血浆直接来源于人体，因此感染病毒的风险较高。对此类制品，需重点加强人血浆来源的病毒风险控制，并确保生产工艺具备高效的病毒清除能力。具体而言，凝血因子产品需实施两步原理不同的病毒去除/灭活步骤，如S/D法和纳滤；免疫球蛋白产品则推荐采用低pH孵育和纳滤等两步不同的病毒去除/灭活方法；而白蛋白产品，其下游纯化采用的低温乙醇生产工艺已具备一定的病毒灭活效果，结合巴氏消毒法可进一步确保病毒安全性。必要时，还需对上市产品进行病毒安全性的追溯。
2）重组治疗性生物制品：此类制品需重点关注工程细胞基质、工程菌、原材料及辅料的病毒污染来源控制，同时确保生产工艺具备强大的病毒清除能力。
3）动物体液/组织来源制品：对于此类制品，应重点考虑起始原材料中动物病毒，尤其是人畜共患病毒的风险控制，并确保生产工艺能有效清除病毒。在必要时，还需对产品进行病毒污染的检测，以确保其安全性。
上游病毒污染来源检测
生物制品的上游污染来源分为内源性和外源性病毒污染两类。内源性病毒污染源包括工程细胞。工程细胞可能源于人的组织或器官、动物的组织或器官、植物的组织或其他来源。这些工程细胞一旦污染病毒，可能会带入到下游工艺，成为病毒污染的源头。对于外源性污染源，主要包括物流控制、人员控制、设施环境和过程监测。
以工程细胞来源生物制品为例，确保细胞库无污染是生物制品生产的重中之重。监管机构对细胞库的污染检测有明确严格的要求。细胞库鉴定要求人和哺乳动物细胞系从主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）到生产终末细胞（EOPC/CAL）的全面的细胞库检定。对于未处理收获液批次放行，要求每个生产批次收获的细胞/未经处理的细胞收获液（UPB）均需进行外源病毒和支原体的检测。其他来源生物制品的病毒污染来源分析和风险控制可以此为参考。
病毒清除定义及实施时间
在GLP实验室环境中，通过应用缩小模型，有目的的将一定量的模型病毒添加（即“加标”）至未加工的收获液或各生产步骤的中间体中。这一做法旨在定量评估灭活/去除病毒工艺步骤的有效性，具体通过测量病毒在工艺过程中的下降水平来实现，并据此确定工艺所能降低的病毒总体水平，以确保产品的安全性。
病毒灭活/去除工艺是保障生物药品安全性的核心环节。根据监管机构的严格规定，生物制品的生产流程必须包含能有效灭活/去除病毒的工艺步骤。在提交IND/BLA申请时，必须提供详尽的病毒清除研究报告。而在产品上市之后，根据实际需求或生产工艺的任何变更，还需对工艺步骤的有效性进行再次验证（Fig.1）。
Fig.1 病毒清除验证时间
指示病毒的选择
指导原则中明确规定，一个典型的验证研究所选病毒应全面覆盖多种类型。具体要求包括：至少应包含单链和双链的RNA及DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒、强弱抵抗力病毒以及大小颗粒病毒。
综合相关法规要求，模型病毒的选择应遵循以下六项原则：
1）需同时包含脂包膜病毒与非脂包膜病毒；
2）要涵盖DNA病毒与RNA病毒；
3）要包括大颗粒病毒与小颗粒病毒；
4）应选择与潜在污染风险相同或相近的病毒；
5）要考虑对所选灭活/去除方法具有较强抗性的病毒；
6）优先选择对实验人员安全的替代指示病毒。
法规还进一步要求，所选指示病毒应尽可能对人类无致病力，与潜在污染病毒相似且易于体外培养，同时需适合具体产品特性及工艺特点，并对验证工艺具有耐受性。
根据这些要求，用于病毒清除研究的模型病毒可分为三类：相关病毒（如血液制品相关的人类病毒）、特异模型病毒（如CHO表达系统的MuLV和MVM病毒）以及非特异模型病毒（如CHO表达系统的PRV和Reo3病毒）。在实际操作中，应优先选择与潜在污染病毒密切相关的病毒，以确保验证研究的有效性和可靠性。
Table 2、Table 3、Table 4分别列出了CHO表达生物制品、杆状病毒/SF9表达系及血液制品中常用的模型病毒及主要特性。
Table 2. CHO表达系中可选用的模型病毒
Table 3. 杆状病毒/SF9表达系中可选用的模型病毒
Table 4. 血液制品中可选用的模型病毒
病毒清除工艺的有效性评估
法规中关于病毒灭活/去除有效性评估的内容明确指出了一系列标准，用以衡量工艺步骤的病毒清除效果。
具体而言，若验证研究中的工艺步骤能够使指示病毒数量被去除/灭活达到4个LRV（Log Reduction Value，对数减少值）或以上，则该步骤的病毒灭活/去除效果被视为有效。对于去除/灭活效果在1至4个LRV之间的工艺步骤，其病毒灭活/去除效果被认定为一般有效。然而，当工艺步骤的去除/灭活效果小于1个LRV时，其病毒灭活/去除效果则被视为不显著。值得注意的是，这些不显著的工艺步骤在评估总体工艺病毒灭活/去除效果时，其LRV数值将不计入总体工艺的病毒灭活/去除LRV总数之中，否则可能会对清除病毒的实际能力估计过高。这些规定为病毒灭活/去除工艺的有效性和可靠性提供了明确的评估标准。
病毒灭活/去除工艺
在病毒清除工艺的选择与具体设计方面，我们需遵循一系列严格的原则和要求。首先，选择工艺时需确保至少包含一步有效的非包膜病毒清除步骤，这是保障病毒清除效果的基础。同时，工艺中还需至少包含两种从机制上能互补且有效的工艺步骤，以增强病毒清除的全面性和可靠性。
在具体设计工艺方案时，我们需进一步细化各项要求。首先，双申报去除/灭活病毒的验证研究必须符合GLP（Good Laboratory Practice，良好实验室规范）的要求，以确保研究的科学性和严谨性。其次，我们需要研究影响去除/灭活病毒效果的各项参数，包括机械参数和理化参数，并确定这些参数允许变化的幅度，通常通过验证最劣条件来确保工艺的稳定性和适应性。
此外，病毒灭活动力学的研究包括病毒灭活速率和灭活曲线的分析，有助于我们更深入地了解病毒灭活的动态过程。同时，为了更准确地评估病毒清除效果，指示病毒的滴度应尽可能高，以模拟最坏情况下的病毒负载。最后，在加入病毒进行验证时，病毒与待验证样品的体积比需控制在一定范围内，一般不超过1∶9，以避免因病毒浓度过高或过低而影响验证结果的准确性。
综上所述，通过遵循这些原则和要求，我们可以设计出更加科学、有效且可靠的病毒清除工艺。常用的病毒灭活/去除工艺如Table 5所示。
Table 5. 病毒灭活/去除工艺
巴氏消毒法
巴氏消毒法是在60℃条件下对蛋白质溶液进行连续加热至少10h，其原理是长时间高温使病毒蛋白变性从而抑制病毒遗传物质的复制，最终使病毒失去传染性。巴氏灭菌法对包膜病毒和非包膜病毒均有效果，是白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂等血液制品常用的病毒灭活方法。
干热法
采用80℃加热72h的处理方法可以灭活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。应该考虑制品的水分含量、制品组成（如：蛋白质、糖、盐和氨基酸）对病毒灭活效果的影响，应确定允许的制品瓶间各参数的差异，同时病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。干热法适用于冻干制剂、凝血因子制品。
有机溶剂/去污剂(S/D, Solvent/Detergent) 法
利用有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜。通常选择磷酸三丁脂 (TNBP) 和非离子化的去污剂（Triton X-100或PS80）组合。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒灭活。因为S/D法引入有机溶剂，所以需要在后续工艺中去除加入的S/D试剂。
如Fig.2所示，使用mAb1和mAb2收获的细胞培养液(HCCF)进行实验，以评估温度和Triton X-100浓度对MuLV灭活的影响。对于这两种单抗，在12℃时的灭活速度比20℃慢，这表明较低的温度和较短的时间是最差的情况，A和B图对比表明0.3%和0.5%Triton X-100对MuLV的灭活效果无差异。
Fig.2 Genentech研究温度(A)、时间(B) 和Triton X-100浓度对X-MuLV灭活的影响
低pH灭活法
低pH灭活法针对包膜病毒而且要求样品在低pH条件下性质稳定。低pH灭活法是重组或者杂交的动物真核细胞经培养后表达、分泌的生物制品和直接采用动物组织原材料经提取、纯化制备的治疗用生物制品常用灭活方法。从病毒灭活效果的角度看：pH越低、孵育温度越高、孵育时间越长或者样品浓度越低，则灭活效果越好。
纳滤膜过滤法
纳滤膜过滤法是当前可靠的病毒清除技术，主要基于尺寸排阻，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔径的蛋白通过滤膜，大于平均孔径的病毒截留在膜内，对各类病毒（包膜病毒和非包膜病毒）达到有效清除。使用20nm左右的滤膜对生物制品溶液进行过滤，去除指数通常可以达到4LRV以上，且不影响产品质量，有效且稳健。
色谱层析法
利用病毒和目标产品在与层析介质接触时亲和力或其他相互作用方面的差别，实现各种组分的分离。层析方法包括亲和层析、阴或阳离子交换、复合模式层析等，Table 6列举了这几种层析方法去除病毒的能力。
层析技术去除病毒，需要考虑层析技术类型和层析填料使用次数（新、旧填料）对于去除病毒效果的差别，一般情况下，新旧填料的病毒清除能力没有显著差异。
Table 6. 层析技术病毒清除结果
国内外申报差异
临床试验申请（IND）阶段
药品申报新药研究申请 (Investigational New Drug, IND) 阶段的要求主要体现在模型病毒的选择、工艺选择和工艺重复性3个方面。Table 7列举了国内外血液制品和抗体/重组蛋白制品在IND申报阶段的要求。
Table 7. 国内外IND申报病毒灭活/去除验证要求
注：血制品中模型病毒选择时，水疱性口炎病毒（VSV）耐受的pH范围比较广，验证低pH孵育法灭活病毒效果时可选用此指示病毒。
生物制品许可申请（BLA）阶段
药品申报生物制品许可申请 (Biologics License Application, BLA) 阶段的要求主要体现在指示病毒的选择、工艺选择和工艺重复性3个方面，同时要求更加严格。Table 8列举国内外血液制品和抗体/重组蛋白制品在BLA申报阶段的要求。
Table 8. 国内外BLA申报病毒灭活/去除验证要求
工艺参数要求
由于在生产规模上进行病毒清除验证研究是不现实的，验证只能按照生产工艺的缩小规模进行。缩小模型在关键参数及控制条件方面应与实际生产工艺严格保持一致。对于层析工艺，亲和层析和阴离子层析表现出有效的病毒清除能力，因此这两个层析步骤也常用于病毒清除验证实验。Table 9列举了亲和层析和阴离子层析（流穿模式）除病毒验证中的最差工艺条件。
Table 9. 工艺参数要求
检测方法
在评估病毒清除效果时，细胞毒性和病毒干扰性是两个必须考虑的关键因素，因为它们会严重干扰病毒滴度的准确测定。因此，在工艺中间品中加入病毒以研究其清除效果之前，首要任务是对这些中间品进行深入的细胞毒性和病毒干扰性研究，以确保准确评估样品中的实际病毒滴度。此外，在病毒灭活/去除的工艺验证环节中，对病毒检测方法的灵敏度、特异性、稳定性和重复性均提出了高要求。
在病毒灭活/去除的工艺验证中，病毒的检测方法要求高灵敏度、高特异性以及很好的稳定性和重复性。目前的病毒检测方法主要为噬斑检测法（定量）、细胞病变法（半定量）、核酸定量（定量检测）。
• 噬斑检测法(PFU 法)：适用于去除和灭活工艺。
• 细胞病变(TCID50 法)：适用于去除和灭活工艺。
• 核酸定量(qPCR 法)：适用于去除工艺；不适用于灭活工艺。
每剂量病毒颗粒估算
对于起始数目可以估算的病毒，如模型逆转录病毒，Fig.3提供了如何计算安全系数的例子。这种计算的基本目的是找出单个病毒颗粒进入单剂量产品的概率，下游病毒灭活/去除工艺4~6个对数的过量清除基本上意味着10^4~10^6个剂量中只有一个剂量可以含病毒颗粒。
Fig.3 计算模型逆转录病毒的安全系数的例子
总结
为了有效控制生物制品的病毒安全性风险，我们必须高度重视起始原材料的污染风险及其检测，同时密切关注生产工艺过程中病毒的清除能力。依据相关法规，我们应制定科学合理的病毒灭活/去除验证工艺以及检测方法，以便准确评估工艺的有效性。此外，在生物制品的整个生命周期内，我们都需要持续进行病毒污染风险的控制与检测，从而降低生物制品的病毒污染风险，确保产品的安全性。
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参考文献
[1] NMPA：生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则，2005.12
[2] NMPA：血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则，2002.05
[3] ICH. Q5A: Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1999
[4]《中国药典》三部2020年版：生物制品通则-生物制品病毒安全性控制
[5] Technical Report No. 83. Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019
[6] FDA：Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. 2011
[7] Cytiva学堂：生物制品病毒灭活/去除验证研究
[8] 国家药典委员会：治疗用生物制品病毒污染风险控制要点，2021
[9] George Miesegaes.(2014)Viral Clearance by Traditional Operations With Significant Knowledge Gaps (Session II): Cation Exchange Chromatography (CEX) and Detergent Inactivation. PDA
[10] Shukla, A. Aranha, H. (2015) Viral clearance for biopharmaceutical downstream processes. Pharmaceutical Bioprocessing.
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